反義核酸包括反義 RNA（antisense RNA）和反義DNA(antisense DNA)兩種，是指與靶RNA（多為mRNA）具有互補序列的RNA或DNA分子。它通過與靶RNA進(jìn)行堿基配對結(jié)合的方式參與基因表達(dá)的調(diào)控。通常把轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNA的基因稱為反義基因（antiscnse gene）或反義DNA，因其與轉(zhuǎn)錄靶RNA的目的基因是反義的［1］。參與基因表達(dá)調(diào)控的反義RNA最早是在原核生物中發(fā)現(xiàn)的，其后又陸續(xù)在原核生物中發(fā)現(xiàn)了多種不同的天然存在的反義RNA，如在質(zhì)粒的復(fù)制、Tn10的轉(zhuǎn)座、噬菌體的繁殖等諸多過程中均發(fā)現(xiàn)了反義RNA調(diào)控系統(tǒng)的存在，顯示原核生物中存在反義調(diào)控系統(tǒng)是一種普遍的現(xiàn)象。在真核生物中雖然迄今未能找到反義RNA調(diào)控系統(tǒng)，但卻檢測出了許多具有互補堿基序列的小分子RNA，推測其中有一部分參與了基因表達(dá)的調(diào)控，可能起著類似反義RNA的作用［2］。廣義地說，反義核酸還包括在體外人工合成的堿基序列與靶mRNA互補的DNA或RNA片段。反義核酸對基因表達(dá)的有效調(diào)控給人類帶來了新的希望，即有可能把反義核酸作為一種生化藥物應(yīng)用，征服人類的大敵如癌癥、病毒類引起的疾病、艾滋病和遺傳性疾病等。
1 反義核酸的作用機理
反義核酸作用原理基于堿基配對規(guī)則，可通過與靶RNA進(jìn)行堿基配對結(jié)合的方式參與對相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控。其作用方式可能有：①反義RNA與mRNA結(jié)合形成互補雙鏈阻斷核糖核蛋白體同mRNA的結(jié)合，從而抑制了mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的過程。②反義DNA能與靶細(xì)胞形成一種三鏈核酸(triple helix nucleic acid),它通過作用于控制基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄子、增強子和啟動子區(qū)，對基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。③反義核酸與mRNA的結(jié)合可阻擋mRNA向細(xì)胞質(zhì)的運輸。④反義核酸與mRNA結(jié)合后使得mRNA更加易被核酸酶識別而降解，從而大大縮短mRNA的半衰期。上述四種作用途徑都可表現(xiàn)為對基因表達(dá)的抑制或調(diào)節(jié)，且這種調(diào)節(jié)是非常特異性的［3,4］。
在人細(xì)胞染色體內(nèi)有30億對堿基，如果4個堿基的數(shù)目大致相同，并在整個基因中隨機分布，則平均12個堿基長度的序列不應(yīng)該重復(fù)出現(xiàn)。因而針對癌基因、病毒基因或遺傳基因來設(shè)計合成反義核酸是理想的基因治療途徑。常見的獲得反義RNA的方法與基因工程方法相同。首先，以mRNA為模板合成互補配對的DNA單鏈，然后以合成的互補DNA單鏈為模板再合成另一條DNA鏈，此雙鏈DNA片段就是目的基因的片段。將目的基因片段反向插入適當(dāng)?shù)妮d體中，然后將重組載體導(dǎo)入細(xì)胞，當(dāng)重組載體基因表達(dá)時，由于是反向插入，因此，啟動引導(dǎo)的不是目的基因的轉(zhuǎn)錄，而是與目的基因互補的反義基因的轉(zhuǎn)錄，從而得到反義RNA。
2 反義核酸類藥物必需符合的條件
假設(shè)應(yīng)用一個反義RNA或反義DNA來抑制某種腫瘤，病毒性疾病或遺傳性疾病的基因表達(dá)而實現(xiàn)治療目的，對此反義核酸應(yīng)符合以下要求（又稱三個S）。
2.1 選擇性（selectivity）
目前，許多癌基因和病毒基因的序列已經(jīng)弄清。因此，只要對其mRNA序列選擇一個區(qū)段設(shè)計所要合成的反義DNA/RNA序列。這些區(qū)段主要包括：5′端帽結(jié)構(gòu)區(qū)；mRNA的起始編碼區(qū)或編碼區(qū)；核前體mRNA的拼接區(qū)；反轉(zhuǎn)錄病毒的引物區(qū)等。這些區(qū)段均為基因表達(dá)的關(guān)鍵區(qū)或敏感區(qū)，對基因的調(diào)控可起“四兩撥千斤”的作用。一般而言，只要人工設(shè)計合成12個以上堿基序列的反義DNA或反義RNA（即反義寡脫氧核苷酸或反義寡核苷酸），就足以使此反義核酸與靶mRNA形成結(jié)合作用，且這種結(jié)合調(diào)節(jié)是非常特異性的。
2.2.1 堿基修飾
堿基是ASON或ASODN（下同）與靶基因通過氫鍵形成而直接接觸的部位，而氫鍵形成又是ASON發(fā)揮功能的必要條件。因此，該部位的修飾應(yīng)以不影響氫鍵形成為前提。在胞嘧啶的5位點甲基化是最常使用的堿基修飾手法，此外，堿基修飾基團(tuán)的種類還包括三氟甲基、炔丙基、咪唑丙基等等［5，6］。
2.2 穩(wěn)定性(stability)
反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASON)或反義寡脫氧核苷酸(antisense oligodeoxynucletide,ASODN)的功能在很大程度上取決于其穩(wěn)定性，ASON或ASODN在體內(nèi)生理條件下，很容易被各種核酸酶降解，這樣就根本無法達(dá)到阻遏mRNA翻譯的目的。因此，人們對反義核酸的結(jié)構(gòu)進(jìn)行各種化學(xué)修飾以提高其穩(wěn)定性，增加對核酸酶的抗性。
2.2.2 骨架修飾
核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成核酸或ASON，磷酸二酯鍵是受核酸酶作用（水解）的敏感位點，在體內(nèi)生理條件下半衰期僅數(shù)分鐘。因此，在正常ASON未與靶基因結(jié)合前即已降解，根本無法發(fā)揮其功能。由于ASON發(fā)揮其特異性抑制基因表達(dá)的關(guān)鍵是堿基排列順序，而與易降解的磷酸和糖環(huán)形成的磷酸二酯鍵骨架無關(guān)，因此。可將此骨架換成聚酰氨（nylon）、嗎啡啉（mophilin）、碳胺酯（carbamate）或肽骨架（peptide），它們不僅非常穩(wěn)定，而且也有相當(dāng)?shù)目共《净钚浴?/div>
ASON或ASODN的磷酸二酯鍵是核酸酶作用的化學(xué)鍵，而磷原子更是核酸酶攻擊的中心，對該原子稍加改變即會大大影響酶的降解作用。故研究最多的化學(xué)修飾即是磷原子，如硫代、甲基化、胺化和酯化等等。此外，參與骨架形成的糖環(huán)修飾包括α構(gòu)型、1′/2′-位取代及3′-3′/5′-5′連接3種。α構(gòu)型修飾是指將天然DNA或RNA的β型核苷鍵替換成α構(gòu)型，使核酸酶不能有效地識別其磷酸二酯鍵。戊糖的1′/2′位引入某些取代基如簡單烷基、烷化劑、嵌入特殊功能分子后，也使ASON或ASODN具備更強的核酸酶抗性。3′-3′/5′-5′連接修飾則是使合成一類具有3′-3′/5′-5′顛倒連接末端的ASON（INV-ASON），結(jié)果使核酸酶不能識別［7～9］。
2.3 溶解性(solubility)
從反義核酸的作用原理來看，它必須溶解于水且又能透過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞中才能與mRNA發(fā)生作用。故ASON或ASODN（下同）的水溶性與脂溶性必需有一個恰到好處的平衡。由于ASON帶負(fù)電荷且有較強的親水性，因此不易與帶同樣電荷的靶細(xì)胞接觸，更不易透過由脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)?；瘜W(xué)修飾是解決這一問題的有效手段，修飾途徑包括引入親脂性基團(tuán)和改變其負(fù)電性等。
在ASON分子上連接親脂性基團(tuán)能加強其親脂性，從而有效地增加其透過生物膜。親脂性基團(tuán)通常通過磷酸或羧酸酯鍵連接于ASON末端的5′-OH或3′-OH上。最常用的親脂性基團(tuán)有脂肪酸（醇），膽酸或膽固醇等。另一項有關(guān)技術(shù)叫Lipofection，是把多陰離子的ASON按電性結(jié)合到陽離子性的修飾磷酯上，以組成具有脂質(zhì)樣釋藥能力的復(fù)合物。也可將ASON與帶有多價陽離子的多聚氨基酸縮合制備成多聚氨基酸-ASON復(fù)合物，一類是Lemaitre等制備的多聚賴氨酸-ASON(PLL-ASON),另一類是Zhang等制備的多聚鳥氨酸-ASON（PLL-ASON）［10,11］。
3 幾種人工合成的反義寡脫氧核苷酸及其應(yīng)用前景
具有潛在治療作用的反義RNA片段可以用體外重組或化學(xué)合成方法制備，但比較起來RNA不如DNA來得穩(wěn)定，而DNA又較容易合成，在序列相同時DNA與RNA都可以與靶m RNA雜交。因此，目前在反義技術(shù)研究較多的是幾種合成的反義DNA。按上述反義核酸的要求，主要對DNA片段中的磷酸部分進(jìn)行修飾。
3.1 正常DNA片段（ODN）
ODN是指化學(xué)合成的、按正常磷酸二酯鍵連接的DNA片段。美國Zamecnik實驗室早在1978年就報道利用人工合成的與勞氏肉瘤病毒（RSV）的m-RNA的5′-和3′-端重復(fù)序列互補的β聚核苷酸，能抑制該病毒增殖，使培養(yǎng)的雞胚細(xì)胞不被轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞［12,13］。他們還合成了一些DNA片段以觀察對艾滋病毒（HIV）的抑制作用：其中12聚、20聚和26聚脫氧核苷酸序列是與病毒mRNA的某些易于進(jìn)攻的區(qū)域互補的。結(jié)果發(fā)現(xiàn)20聚片段對逆轉(zhuǎn)錄酶有67％抑制，對其表達(dá)產(chǎn)物P15和P24蛋白分別有95％和88％抑制［14］。裘慕綏等報道反義ODN對小鼠腹水瘤病毒（SRSV）這種逆轉(zhuǎn)錄病毒有抑制作用，用互補于病毒RNA基因5′端引物tRNA區(qū)的15聚ODN，可使病毒感染宿主細(xì)胞生長抑制90％［15］。許毅等針對人胃癌基因（c-Ha-ras 基因）合成了2個15聚ODN，一個是與c-Ha-ras mRNA的前三個密碼子及其上游區(qū)的核蛋白體結(jié)合點附近的單鏈區(qū)互補，另一個是與細(xì)胞核內(nèi)未成熟的c-Ha-ras mRNA第一個內(nèi)含子3′端及第二個外顯子5′端區(qū)域互補，它們可分別阻斷c-Ha-ras mRNA的翻譯和拼接過程，從而降低c-Ha-ras癌基因的表達(dá)水平［16］。
3.2 甲基化磷酸型DNA片段（M-ODN）
對化學(xué)合成的反義ODN的磷酸二酯鍵進(jìn)行化學(xué)修飾，使甲基取代磷酸二酯鍵部分中的羥基而得到ODN的類似物，稱之為M-ODN。甲基化的結(jié)果使原DNA帶眾多負(fù)電荷變成非離子型分子而增加脂溶性，它能完整地穿過細(xì)胞膜并且不易被核酸酶水解，能與互補的核酸區(qū)段形成復(fù)合物。這方面最出色的工作是由美國Miller等實驗室完成的。他們曾報道M-ODN可與大腸桿菌16s rRNA的基因序列（Shine-Dalgarno序列）雜交而阻斷其增殖［17］。Blake等報告特異性的M-ODN能與相應(yīng)的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞及其裂解液中的核酸片段內(nèi)mRNA模板起始編碼區(qū)5′端雜交，有選擇性地抑制珠蛋白mRNA的活性，干擾其產(chǎn)物N蛋白，NS蛋白的合成［18］。M-ODN的缺點是當(dāng)其長度超過12個堿基對時在水中就不溶解。尤其是在磷原子上引入甲基后即造成手性，理論上帶有n個堿基對的M-ODN可以具有2n-1個對映異構(gòu)體，這無疑會給分離純化帶來困難。
3.3 硫代磷酸型DNA片段（S-ODN）
這是磷酸二酯鍵部分中的羥基被巰基取代而生成的ODN類似物。它的特點是：雖然仍帶負(fù)電荷，卻可完整地進(jìn)入細(xì)胞，抗核酸酶降解的能力也較強，水溶性也較好，并且能與互補的核酸區(qū)生成復(fù)合物以抑制mRNA的翻譯。目前已知艾滋病毒（HIV）的BIO基因組中存在一種art/trs外顯編碼子Ⅰ的RNA序列，它能調(diào)節(jié)HIV的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，故針對這些密碼子區(qū)段的序列 人們合成了一系列的S-ODN。14聚脫氧核苷酸的S-ODN在25 μmol/L濃度時即對HIV的細(xì)胞病變有95％的抑制作用，而ODN和M-ODN只分別產(chǎn)生4％和10％的抑制。慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）患者白血病細(xì)胞中含有Ph染色體，它是9號染色體上c-abl原癌基因易位到22號染色體形成bcr/abl嵌合基因，該基因編碼一種具有酪氨酸激酶活性的P210bcr/abl蛋白（致癌蛋白）。針對bcr/abl嵌合基因的位點及C-myb癌基因序列，韓金祥等設(shè)計并合成了反義ODN與反義S-ODN，結(jié)果顯示，兩者均可抑制bcr/abl嵌合基因的表達(dá)，可誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡，同時也抑制異常增殖。而反義S-ODN比反義ODN作用效果更好，表現(xiàn)在抑制效果快且持續(xù)時間長，抑制率達(dá)85.1%［19］。
4 反核酸問題與展望
對癌癥、艾滋病一類病毒性疾病及遺傳性疾病，迄今人們?nèi)晕茨苷业礁蔚耐緩胶退幬铩７戳x核酸的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用無疑是一個令人憧憬的途徑，因為它對致病基因有特異性地抑制作用。目前在醫(yī)藥領(lǐng)域中進(jìn)行的研究主要集中在反義核酸的合成及化學(xué)修飾，絕大部分是在體外進(jìn)行藥理試驗，包括抗病毒（如HIV、HSV等）、抗原蟲（如布氏錐蟲）、抗惡性腫瘤的試驗。但對反義核酸進(jìn)入細(xì)胞的方式和過程，對核酸酶的穩(wěn)定性、發(fā)揮作用的具體機制及在動物體內(nèi)的試驗則很少有報道，只有一些會議簡報但實驗數(shù)據(jù)甚少。另外，如何尋找更有效的合成方法并轉(zhuǎn)化成可操作性的工藝技術(shù)，以便使大量制備反義核酸并對其劑型加以改造，使之能供動物體內(nèi)試驗和人體臨床試用成為可能，也是亟待解決的問題。還有關(guān)于反義核酸的毒性和致突變性，就目前動物實驗資料看是安全的，但仍須更深入進(jìn)行這方面的研究，才能使反義核酸類藥物真正滿足藥物應(yīng)用的嚴(yán)格要求。
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